为什么要进行细胞冻存？

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来





，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验


。而且适度地保存一定量的细胞


，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用



。

除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠

、交换和运送某些细胞
。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)
，可使溶液冰点降低

，加之在缓慢冻结条件下
，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤
。 

采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)

。

细胞冻存的步骤

（1）选择处于对数生长期的细胞


，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉






，用0.25% 胰蛋白酶消化


。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液

。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理
。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)
。
（2）去上清液
，加入含20%小牛血清的完全培养基
，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油
，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
，细胞浓度为5×10⁶～1×10⁷/mL之间


。
（3）将分装上述细胞悬液于2ml冻存管中
，每管0.25ml

。冻存管要将盖子盖紧
，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期




、细胞种类及代次

、冻存支数）。
（4）将装好细胞的冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜

。
；如果有程序降温器(放在-80℃冰箱过夜
，放入液氮罐)最好;或者可以在4℃

，2h;然后转到-20℃
，2h;-80℃


，2h;放入液氮罐
。
（5）细胞冻存在液氮中可以长期保存
，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只冻存管细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

如何进行细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管
，直接浸入37℃温水中


，并不时摇动令其尽快融化
。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子
，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液
，混匀;

3. 离心


， 1000rpm，5min;

4. 弃去上清液




，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞


，计数
，调整细胞密度
，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养;

5. 次日更换一次培养液，继续培养

。