必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃
，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化
，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶



，对细胞造成损害
。

细胞复苏步骤

一.实验前准备



：
将水浴锅预热至37℃
。
细胞实验室进行常规消毒
，用75％酒精擦拭并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面。
在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管




、吸管、培养瓶等
。

二．取出冻存管

：
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号
。
从液氮罐中取出细胞盒
，取出所需的细胞
，同时核对管外的编号。

三．迅速解冻：
迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动




，使管中的液体迅速融化。
约1-2min后冻存管内液体完全溶解




，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内


。

四.平衡离心




：
用架盘天平平衡后，放入离心机中1000r/min


，离心5min

。

五.制备细胞悬液：
吸弃上清液

。
向离心管内加入10ml预热的培养液
，吹打制成细胞悬液

。
用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度

，放培养箱中培养。

六.细胞计数：
细胞浓度以5×105/ml为宜




。

七.培养细胞
：
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养



，换液的时间由细胞情况而定。

八. 记录复苏日期
：
细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面容易出问题的部分

，因此必须注意以下几点~

注意无菌操作
。
取细胞的过程中可能会接触液氮，一定注意带好防冻手套，护目镜
。
此项尤为重要，如果冻存管密封不严
，细胞冻存管可能漏入液氮

，解冻时
，在水浴中摇晃

，冻存管中的气温急剧上升

，可导致爆炸
，所以







，一定要戴保护眼镜和手套，复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖。
应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外






，细胞复苏后的操作Hao在4℃冰浴中进行







，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性
。
复苏过程中

，升温的速率要大




，把从液氮取出的细胞在短的时间内放入水浴锅
。
离心前须加入少量培养液
。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤

。

细胞贴壁少的问题
：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液
，经验总结


，培养基越少细胞越容易贴附
。
复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中


，分装过多

，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果加培养基的太少

，DMSO的浓度就会比较大



，就会影响细胞生长
，从以前的资料来看

，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1％。所以如果冻存液的浓度是10％DMSO

，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度



。

初学者易犯的错误
：
水浴锅未预热或者未预热到37℃直接融化。
水浴锅内冻存管太多
，导致传热不佳
，使融化时间延长


。
离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失

。
一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管

，导致细胞交叉污染
。
解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的
，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡
，像水土不服一样。

结果分析

：
判断细胞复苏成功与否
，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞


，活细胞不着色


。用细胞计数板和计数器计数细胞
，得出细胞存活率）
。如果复苏后95%以上的细胞贴壁
，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题

。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量

。