1、ELISA试验的稳定性问题?

　　做ELISA实验时
，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5
，下午做时就是0.9了





，所以都没有办法下结论
，为什么会差异这么大呀

？?

　　（1）多设平行空孔，?请别人代劳，以判断究竟是否操作问题?

　　（2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边

　　缘



，那么在重复的时候
，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂
，这个就很正常了。建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上




。?

　　2

、酶不稳定


，有何高招

？?

　　（1）保存浓度尽量高些，?

　　（2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解
。?

　　（3）加入50%甘油-20度保存
、避免反复冻融




。?

　　（4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠
，其对HRP活性有很大影响）?（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应
，可以考虑一下?酶类的稳定性与保存方法的很大关系
。干燥的制品一般比较稳定


，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化


，贮藏要求简单

，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封


，保持0－4度冰箱即可。液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：?1
、样品不能太稀
，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏

，样品太稀易降解、变性


。?2



、一般需加入防腐剂和稳定剂




，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖
、甘油等
，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性
。此外
，钙、锌

、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。?3
、贮藏温度要求低，避免反复冻融

。??

　　3


、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀

？?

　　做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值


，是什么原因呀
？?

　　最大的原因是封闭的效果不好
，应该调整封闭液；?

　　可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度
、时间，试试哪个效果好?

　　阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果??

　　4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢
？?

　　我做ELISA时
，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高

，有时候高出0.1个OD





，导致实验经常重复


，但原因也找不到在哪里？?

　　这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。?ELISA的边缘效应是指边缘孔与中心孔反应条件不一致



，由于边缘效应的影响
，同一标本在边缘孔测定的结果明显高于中央孔
，且随边缘孔与中央孔的距离的增加而增强。原因在于试验过程中边缘孔与中央孔的温度
、液体蒸发程度不同以及各孔表面存在光洁度等物理性状的差异有关


。为克服其影响
，应尽可能使用中央孔及其周围反应孔
。ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。?另外
，酶标板也是一个比较重要的因素
，选择质量好一点的板能一定程度减少板内误差，我用costar的板，到目前为止还没有出现边缘孔与中心孔反应不均的情况
。??

　　5
、做ELISA对梯度怎么要求的啊？?

　　做ELISA的时候老板让EBET易博选择的抗原or抗体都是有明显梯度的，不是很明白他们的观点
，有时候稀释不同的倍数但是活性相差不大
，就象在一个平台区段自己感觉在这么一个范围里面都可以使用应该更好
，这样即使是有很小的取样误差也不会影响实验，应该更好才对

！做ELISA对梯度这么要求究竟是什么目的



，具体怎么要求的啊

？?

　　（1）?EBET易博做ELISA试验时是要求梯度比较明显的才是好的抗原，每个抗原都会有一

　　个最适平台期
，就是在这个范围之内变化浮动不会很明显
，所以EBET易博会选择平台期的起点不会选择终点
。如果你没有做到他的下限的话就不会知道抗原在哪个浓度时是平台期的终点
，有可能你选择的是终点，这样就不是最佳的抗原浓度



。等到做稳定性试验时灵敏度应该会下降的很明显。?

　　既然选择的是平台期的起点
，那么也就是再往后是一个平台期了，那也不会有什么梯度了，这样看得话有明显梯度的

，如果处于下降阶段的反倒没什么用了，这样更难找平台期的起点？?

　　（2）?看你走的包被浓度的范围怎么样，如果跨度很大的话




，梯度就会很明显


。反之


，

　　跨度小的话就不会有很明显的梯度

，说明你应该在这一段之间选择最适浓度?

　　6


、做elisa试剂盒一定要带上阴阳性对照吗？对试剂盒起到什么作用？?

　　对照最最基本的作用是评价你的实验体系


：阴性对照验证你的实验是否存在污染造成假阳性






；阳性标本验证你的实验体系是否成立
。?可以不做

，但出了问题你会抓不找头绪
，不知道问题出在什么地方
。此外



，如果作为实验数据必须要有对照


。?

　　阳性对照品(positive?control)和阴性对照品(negative?control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品

，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致

。以人血清为标本的测定
，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底


。?阴性对照品须先行检测
，确定其中不含待测物质


。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg

，最好抗HBs也是阴性




。?阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质
，阳性判定值（cut-off?value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准

。?质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值
，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平

，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定
，应按临床要求

，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。?临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品

，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平

，确保弱阳性反应的标本不漏检
。??

　　7

、把酶加到显色剂中A和B中，为什么在A中酶活性掉得比较慢


，但是在B中就掉得很快
，是什么原因呢
？?

　　HRP的显色试剂

，不管是直接显色的还是曝光的，A液都是显色底物

，但不是直接与HRP作用的，而是呈色/曝光的底物（DAB，TMB,?Luminol等）

，它们的直接激活物是O2－

；B液一般是过氧化氢，这才是HRP的直接底物。?整个HRP显色的过程是

：过氧化氢被HRP催化放出O2－


，然后作用于呈色/曝光底物

，产生颜色/发光现象
。由于过氧化氢性质不稳定，所以不能将它与显色/发光底物长时间保存一起








，所以一般的Kit都是装成A


、B两管
。?

　　8

、夹心ELISA中本底高


，该如何控制

？?

　　本人在夹心ELISA实验中
，先用一种单抗包被ELISA板，使用的酶标抗体是biotin标记的另一单抗，但问题是本底高
，该如何控制

？?

　　可能出现的原因有



：?

　　1。单抗与后续的生物素标记的抗体发生了非特异性吸附
，所以加入HRP标记的链亲和素时
，导致OD值相应增加
；?

　　2


。加入HRP标记的链亲和素的浓度过高
，洗涤不彻底；?3
。封闭不完全?

　　4
。生物素标记的抗体与封闭剂发生非特异性吸附??

　　9、检测脑钠肽时为什么要加入EDTA和抑肽酶啊?

　　加入EDTA的目的是抗凝,获取血浆进行分析.?

　　要加入适量的抑肽酶
，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解。