猪白细胞介素10定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测猪血清
、血浆或细胞培养上清液中的IL-10浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有产品包装破损或质量投拆
，请在收到货一个月之内联系EBET易博









。

IL-10简介：

IL-10是个多效性的因子



，能够对多种细胞起作用
，主要表现为免疫抑制和免疫刺激两方面的作用，特别是在调节淋巴系和髓系的细胞功能方面扮演重要的作用


。IL-10 也具有单核细胞/巨噬细胞依赖
、抗原刺激引起的的PBMNC 和 NK 细胞合成其它细胞因子的抑制作用


。巨噬细胞膜介导的共刺激引起的T细胞和NK细胞活化后的产物及功能也可被IL-10所抑制





。IL-10是单核细胞/巨噬细胞功能的强有力的调节物

。IL-10作为细胞介导的免疫反应的抑制物
，能够抑制像前列腺素E2
、TNF-α
、IL-1、IL-10和 IL-8等许多引起炎症的细胞因子。IL-10 能够促进可溶性TNF受体的释放和ICAM－1和B7在细胞表面的表达。IL-10还参与B细胞

、柱状细胞及胸腺细胞的增殖和分化的调控



。在许多与寄生虫感染的报道中，IL－10表达也会增加，如曼森氏血吸虫感染
、利什曼原虫感染、弓形虫感染、锥虫感染等
。分枝杆菌的感染如麻风分枝杆菌、结核杆菌



、 鸟分枝杆菌等的感染也会引起IL－10的表达升高。

IL-10在DNA序列和氨基酸序列上高度同源
，其DNA序列中一个开放的基因框与艾伯斯坦-巴尔病毒基因组上基因框BCRF1高度同源，这可能在病毒感染中扮演重要角色的原因
。在许多与寄生虫感染的报道中

，IL－10表达也会增加，如曼森氏血吸虫感染

、利什曼原虫感染


、弓形虫感染
、锥虫感染等

。分枝杆菌的感染如麻风分枝杆菌、结核杆菌、 鸟分枝杆菌等的感染也会引起IL－10的表达升高。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-10 的浓度
。IL-10 捕获抗体已预包被于酶标板上

，当加入标本或参考品时
，其中的IL-10 会与捕获抗体结合
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗猪IL-10 抗体后，抗猪IL-10 抗体与IL-10 接合

，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合


，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂，若样本中存在IL-10 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质
，在加入终止液后呈黄色




。通过酶标仪检测


，读其450nm处的OD值，IL-10 浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线
，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-10 浓度

。

猪IL-10定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可

；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清

，避免在冰箱中凝固血液
；

C.血浆标本
，推荐用EDTA的方法收集


；

D.若待测样本不能及时检测


，标本收集后请分装


，冻存于－20℃，避免反复冻融


。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明
，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除



。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确



。

注：猪血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃

。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后
，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属
。

5.加样时
，请及时更换枪头，避免交叉污染
。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份

。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要


，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应

，请严格控制在25～28℃
。

9.洗涤过程是至关重要的


，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔
。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时


，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟
；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存




。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)


。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-10终浓度达到1500pg/ml

，室温反应

，请严格控制在25～28℃
，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解



，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点
，最高浓度为1500 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或猪工洗板



：每孔洗涤液为300ul
，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头
；   

2.酶标仪
；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数
，取出所需板条放置在框架内
，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃




。

2.建议设置本底较正孔
，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中

，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本


，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大


，请将样本与样本分析缓冲液等量加入

，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。    

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干


。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)




。用封板胶纸封住反应孔
，室温（25-28℃）孵育60分钟。   

6.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)

。用封板胶纸封住反应孔


，避光室温（25-28℃）孵育20分钟

。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干







。

9.加入显色剂TMB100ul/孔
，避光室温（25-28℃）孵育20分钟
。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效


，复孔的值平均后可作为测量值
。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值





。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标
，OD值作纵坐标


，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数


。

典型数值和参考曲线

猪IL-10参考标准曲线

注意


：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度

，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为34.5pg/ml

。

2.特异性
：与人
、小鼠



、大鼠的IL-10及猪的IFN-γ均无交叉反应性
。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Sennikov, S.V. et al. (2002) Cytokine 17:221.

2. Kotenko, S.V. et al. (1997) EMBO J. 16:5894.

3.. Gruenberg, B.H. et al. (2001) Genes Immun. 2:329.

4. Rich, B.E. and T.S. Kupper (2001) Curr. Biol. 11:R531.

5. Fickenscher, H. et. al. (2002) Trends Immunol. 23:89.

6. Rea, D. et al. (2000) Blood 95:3162.

7. Olikowsky, T. et al. (1997) Immunology 91:104.

8. Iwasaki, A. and B.L. Kelsall (1999) J. Exp. Med. 190:229.

9. Moore, K.W. et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19:683